近日，广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心邓伟豪团队在Nature Cardiovascular Research期刊上发表了题为“Gasdermin D-dependent platelet pyroptosis exacerbates NET formation and inflammation in severe sepsis”的文章，华大基因为该研究提供DIA蛋白质组技术支持。

该研究首次报道在脓毒症中存在血小板焦亡，使用DIA定量蛋白组技术筛选出差异表达蛋白GSDMD，通过一系列实验揭示了脓毒症条件下存在血小板和NET间的正反馈调节，从而加剧免疫反应。

该研究为脓毒症致病机制解析及治疗靶点筛选提供理论基础和依据。（点击“此处”查看论文原文）

脓毒症（sepsis）是目前全球公认的高发病率和高致死率的公共卫生疾病，儿童脓毒症是导致全球范围内儿童死亡，发病和巨大医疗费用的主要原因，在短时间内可以迅速恶化，因此进行早期治疗尤为重要。以往对脓毒症的研究多集中在免疫细胞的功能失调方面，对其发病机制的系统研究较少，导致缺乏有效的疗法。

血小板病变被认为参与了脓毒症的恶化，导致更高的死亡率，目前已成为脓毒症病理研究中涉及的关键炎症细胞[1]。细胞焦亡是一种炎症或感染引起的程序化细胞死亡，对免疫至关重要，之前有报道血小板具有引起焦亡的必要成分如NLRP3炎症小体和ASC、caspase 1和白细胞介素1β（IL-1β）[2,3]，可能存在NLRP3调控的细胞焦亡。但是血小板是否发生焦亡，以及在脓毒症恶化过程中的作用还尚未明确。

本研究先利用DIA定量蛋白质组技术进行了大规模差异蛋白的筛选，进而采用一系列验证手段及生物学实验，对血小板在脓毒症中的作用机制进行了全面细致的研究，为脓毒症的诊断和治疗提供了重要依据。

研究表明DIA定量蛋白质组在血小板中应用的可行性；同时研究的整体思路，“发现+验证”模式也是蛋白质组学领域常见的研究思路。在验证阶段除了采用常规western-blot之外，对于无商业化抗体的蛋白、或者需要验证蛋白数目较多时，还可以使用基于质谱的MRM/PRM靶向蛋白检测技术。 

以下为研究解读：

研究思路

主要研究成果

1、脓毒症血小板特征和蛋白质组学分析
研究人员对儿童脓毒症患者（n=37）、严重脓毒症患者（n=22）和脓毒性休克患者（n=34）以及健康受试者（HS；n=75）进行观察，发现严重脓毒症/脓毒性休克患者与脓毒症患者（无严重脓毒症/脓毒性休克）相比具有更高死亡率和并发症。严重脓毒症患者促炎细胞因子、降钙素原和C反应蛋白显著提高，并伴有血小板病和凝血症。

严重脓毒症中血小板蛋白质组学分析

研究人员收集了来自3例严重脓毒症（伴或不伴脓毒症休克）和3例健康样本（HS）的纯化血小板样本， 通过DIA-MS进行高通量蛋白质组学分析，总计鉴定了3,892种蛋白质，并对3,542种蛋白质进行了定量，脓毒症组有185个差异表达蛋白，160个显著上调，25个下调；通路分析表示凋亡（包含焦亡）和坏死途径显著上调，其中GSDMD（关键细胞焦亡调节蛋白）表达显著上调。采用FACS（流式细胞荧光分选技术）进一步分析脓毒性血小板的细胞死亡类型，数据表明细胞焦亡是发生严重脓毒症时血小板细胞死亡的主要形式。

2、在严重脓毒症血小板中发现GSDMD依赖的细胞焦亡

脓毒症血小板发生GSDMD依赖性焦亡

研究人员透射电镜（TMT）检测到严重脓毒症血小板发生细胞焦亡；免疫荧光显示在严重脓毒症患者的血小板中NLRP3炎性小体与ASC结合；Western blotting表明严重脓毒症患者血小板中caspase 1、激活的GSDMD蛋白（cleaved GSDMD-N）、IL-1β含量都显著增加，与DIA结果一致，这些结果说明在严重脓毒症患者中血小板焦亡被激活。对血小板特异性Gsdmd敲除小鼠（Gsdmdfl/fl PF4-Cre）进行LPS/CLP（诱导血小板焦亡）处理，结果在基因敲除小鼠中未发现血小板焦亡现象，验证了GSDMD是触发血小板焦亡的必要调控分子。

3、脓毒症发病机制推测及验证

血小板焦亡-NET正反馈回路

严重脓毒症患者的血小板焦亡比例与血浆S100A8/A9水平呈正相关。S100A8/A9处理的血小板中NLRP3炎症小体与ASC发生组装，且激活的caspase 1和GSDMD也显著增加。基因重组小鼠S100A8/A9与CLP处理一样发生血小板焦亡。通过构建TLR4敲除小鼠模型（Tlr4-/-），验证了S100A8/A9通过TLR4途径诱导血小板焦亡。

严重脓毒症患者血小板表现出线粒体功能障碍，ROS升高。小鼠在S100A8/A9处理下，血小板的线粒体膜电位异常且ROS增加，但在TLR4敲除小鼠（Tlr4-/-）中没有变化。根据之前的报道，ROS是NLRP3炎症小体的激活因子，利用线粒体抗氧化剂处理严重脓毒症血小板抑制ROS产生，验证了ROS受S100A8/A9-TLR4途径调控，对激活NLRP3炎症小体和caspase 1是必需的。

严重脓毒症患者的血浆中中性粒细胞胞外杀菌网（NET）显著增加，且NET的形成和血小板焦亡呈正相关，中性粒细胞（PMN）与rmS100A8/A9处理的Tlr4-/-/WT血小板共同孵育，Tlr4-/-血小板显著抑制了PMN中NET的形成。S100A8/A9处理的血小板上清与严重脓毒症患者、CLP处理的小鼠血浆中ox-mtDNA都显著升高，通过抑制ROS产生可以抑制ox-mtDNA水平，通过小鼠敲除模型证明了S100A8/A9诱导的Gsdmd依赖性血小板焦亡通过释放ox-mtDNA促进形成NET，增强炎症和严重脓毒症死亡率。同时NET促进S100A8/A9水平的增加，促进血小板焦亡。

研究结论

本研究采用DIA定量蛋白质组分析筛选出脓毒症差异蛋白GSDMD，通过验证发现在严重脓毒症血小板中存在GSDMD依赖的细胞焦亡，使用三种不同的敲除基因小鼠模型（Gsdmdfl/fl PF4-Cre，Tlr4−/−和S100a9−/−），证明脓毒症来源的S100A8/A9通过TLR4/ROS/NLRP3/caspase 1途径诱导GSDMD依赖性血小板发生焦亡，导致ox-mtDNA释放，促进NET形成。同时NET反过来释放S100A8/A9，加速血小板焦亡，形成一个正反馈循环，从而加剧脓毒症的免疫反应。

因此，对于伴有血小板焦亡的严重脓毒症患者，通过靶向S100A8/A9或血小板特异性GSDMD可能成为一种非常必要辅助治疗手段。

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参考文献：
[1] Vardon-Bounes, F. et al. Platelets are critical key players in sepsis. Int. J. Mol. Sci. 20, 3494 (2019).
[2] Cornelius, D. C. et al. NLRP3 inflammasome activation in platelets in response to sepsis. Physiol. Rep. 7, e14073 (2019).
[3] Wang, S. et al. Reduced intracellular antioxidant capacity in platelets contributes to primary immune thrombocytopenia via ROS-NLRP3-caspase-1 pathway. Thromb. Res. 199, 1–9 (2021).