家猪在器官大小、结构、解剖学、遗传学和生理功能方面与人高度相似，被认为是人最有希望的异种移植来源。但由于猪和人之间存在一些物种特异性的细胞和分子差异，异种器官移植的临床表现有待改进。为了解这两者之间的生物医学相似性和差异，并推动猪在生物医学研究中的应用，需要更深入地理解家猪器官中细胞组成的异质性和相互作用。

2022年6月，深圳华大生命科学研究院罗永伦教授联合丹麦奥胡斯大学林琳教授等多家国内外科研团队于Nature Communications（影响因子17.694）发表名为“Endothelial cell heterogeneity and microglia regulons revealed by a pig cell landscape at single-cell level”的文章，基于华大自主单细胞DNBelab C系列平台，利用单细胞转录组测序首次构建家猪多个组织和器官的单细胞转录组图谱。

样本设计

实验共收集20种猪组织/器官，其中9个组织通过高通量单细胞转录组测序（scRNA-Seq）分析，包括内脏和皮下脂肪、脾脏、肠、肝脏、肺、外周血单个核细胞（PBMC）、全脑和视网膜；15个组织通过高通量单核转录组测序（snRNA-Seq）分析，包括9个脑区（延髓最后区、小脑、穹窿下器官、终板血管器官、额叶、下丘脑、枕叶、顶叶和颞叶）、视网膜、肾脏、心脏、脾脏、肝脏和肺；4种猪组织（肝脏、视网膜、肺、脾）同时采用scRNA-Seq和snRNA-Seq分析；最终获得133,492个细胞和89,034个细胞核转录组数据。

技术点睛

1单细胞动态分析

从细胞和基因两个维度对内皮间质转分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）细胞进行拟时间轨迹分析，发现并证实了EndMT细胞经历从内皮细胞（endothelial cells，EC）到间充质细胞的动态发育转变。

2与公共数据库比对

将得到的猪内皮细胞转录组数据，与已公开的人数据合并对比，探索人与猪之间共有和差异的细胞间信号通路，为解释异种器官移植免疫排斥反应提供数据支持。

3跨物种保守分析

将得到的猪脑小胶质细胞转录组数据，与已公开的人、小鼠等其他物种的数据合并对比，解析跨物种的转录调控保守性和特异性，为研究人脑神经疾病提供基础理论依据。

技术路线

研究结论

1跨绘制猪单细胞转录组图谱

通过对单细胞转录组数据降维可视化（tSNE）和聚类分析，从20种猪组织中共鉴定到234个细胞类型，揭示了猪多种组织的细胞组成异质性。结果表明，某些细胞类型仅存在于特定的组织中，如米色脂肪细胞仅在脂肪组织中。

此外还鉴定到几种组织中共有的细胞类型，例如跨19种不同组织（PBMC除外）的内皮细胞。研究人员进一步构建了家猪单细胞转录组图谱数据库（Pig Single Cell Atlas Database）。

2揭示内皮细胞（ECs）异质性

血管内皮细胞与异种器官移植的免疫排斥反应密切相关，因此，研究人员重点解析了内皮细胞的异质性。共获得了9,520个ECs，其中56%的EC来自脂肪组织。所有EC聚类得到21个内皮细胞亚型，其中包括三种特异功能表型：增殖型、免疫激活型和内皮间质转分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）细胞类型。

为了进一步验证间充质样EC表型，研究人员进行了细胞和基因的拟时间轨迹分析，证明EndMT细胞经历了从ECs到间充质细胞的动态发育转变，同时还发现TGF-β信号通路（TGFB2）是驱动EndMT过程的关键诱导因子。TGF-β2定向诱导分化、免疫荧光染色和流式细胞术也证实了上述结果。

图3 猪组织中内皮细胞的单细胞转录组分析

图4 TGF-β2定向诱导分化的结果验证

3分析内皮细胞（ECs）与其他细胞类型之间的通讯网络

ECs和组织中其他实质细胞之间的通讯在维持正常组织生长、发育和体内平衡的结构和功能中起着至关重要的作用。研究人员使用CellChat工具分析了肝脏、肾脏和心脏中ECs和其他细胞类型之间的通讯网络，并与人相同器官的细胞间通讯网络进行了比较。结果表明，在人和猪的肝脏、肾脏和心脏中，ECs主要通过血管内皮生长因子（VEGF）、PDGF 、TGF-β等信号通路与其他细胞类型交流。ECs和其他组织类型之间存在基于TGF-β的细胞间通讯进一步表明了诱导EndMT细胞类型的潜在机制。

图5 猪和人之间的细胞通讯比较

4鉴定跨物种小胶质细胞的保守和差异转录因子

同小型模式动物相比，猪大脑结构与人更加接近，因此被认为是研究人脑退行性神经疾病的重要动物模型。小胶质细胞是大脑的主要常驻免疫细胞，维持着大脑稳态，并涉及多种脑疾病如肌萎缩侧索硬化。

为了表征猪中小胶质细胞的保护和分化，研究人员利用单细胞遗传调控网络（GRNs）推断和聚类分析了家猪、人、小鼠等13个不同物种的小胶质细胞的单细胞数据集。

结果表明，MEF2C存在于大部分物种的转录因子（Transcription Factor，TF）靶对中，是调节与小胶质细胞功能相关的多个关键基因的核心保守TF，可能在小胶质细胞分子遗传进化过程中起到非常关键的作用。

图6 脑细胞类型的验证和小胶质细胞调节因子的跨物种比较

总结

综上所述，该研究应用单细胞转录组测序首次构建家猪多组织和器官的细胞图谱，证实猪内皮细胞存在着高度的细胞和功能异质性；接着发现和验证了脂肪组织中存在内皮间质转分化细胞亚型（EndMT），以及证明TGF-β2信号通路在EndMT转分化中的关键作用。该研究进一步揭示了脑小胶质细胞遗传保守转录调控网络。

以上发现为利用家猪研究人心血管疾病和改善异种器官移植免疫排斥反应提供关键科研资源和科学基础，同时为跨物种的小胶质细胞进化提供了保守和差异转录因子的宝贵资源，对人脑疾病中的小胶质细胞进化模块研究具有重要意义。

截至目前，华大DNBelab C系列单细胞平台已助力发表文章23篇，平均影响因子多达17+。

参考链接
[1]https://doi.org/10.1038/s41467-022-31388-z
[2]https://dreamapp.biomed.au.dk/pigatlas/