临床进行遗传病诊断时，经常会遇到“假基因”的困扰，例如临床常见的内分泌疾病——先天性肾上腺皮质增生症，其经典型21-羟化酶缺乏性肾上腺皮质增生症 (Adrenal hyperplasia, congenital, due to 21-hydroxylase deficiency，CAH）的临床诊断最主要干扰项就是致病基因CYP21A2的假基因CYP21A1P。

为提高21-羟化酶缺乏性肾上腺皮质增生症的诊断率，更好服务临床医生和患者，华大基因对检测产品进行了优化升级，整合Sanger测通、MLPA检测和高通量测序三种检测方法，不仅可以针对CYP21A2基因上10个外显子区域的点突变进行检测，还可以通过三个不同方法学的交叉对比确认点突变的真实性，同时有效检出拷贝数变异以及基因微转换的情况。

这样可以更清晰地还原CAH致病变异的真实情况，助力临床精准诊断。 

同时，华大基因对羊水样本进行了测试，测试数据和结果都保持良好的均一性和稳定性。为保证产前样本不受母源DNA污染，专门设置了针对产前、内置母源污染的STR检测，即胎儿及母血样本送检后先行STR检测确认无母源污染后，再对CYP21A2进行升级后的多方法学联合检测，最大限度的满足临床产前样本的需求。

什么是假基因

假基因 （Pseudogenes，Pseudo-意为“假”）是一类在染色体上的基因片段。假基因的序列通常与对应的真基因很相似，但至少是丧失了一部分功能，如基因不表达或编码的蛋白质没有功能。

这一名词是由Jacq等人于1977年最早提出的。长期以来生物学家们认为假基因是没有功能的垃圾DNA，唯近年来的研究还表明假基因拥有调控基因表达的功能，一部分假基因在某些疾病的发展中也扮演着重要角色。

简单的理解就是，真基因=编码功能蛋白的基因；假基因=不编码功能蛋白的基因。由于假基因序列与真基因高度相似 （或者部分区段高度相似） ，因此也可以称其为真基因的同源序列。

目前已有一些假基因形成的学说：左图表示基因转录翻译生成蛋白质的过程，右上图为假基因形成的传统学说——在基因复制后，其中的一个基因发生了突变而成为了假基因。而新学说 (右下图) 则认为，假基因可能是由真基因转录生成的RNA通过逆转录进一步整合到DNA上形成的。

脊髓性肌肉萎缩症 (SMA) 的致病基因SMN1就存在一个假基因SMN2，两者序列同源性>99.9%，仅有5个碱基存在差异。虽然SMN2编码的蛋白功能存在缺陷，但对于罹患SMA的患者而言，其体内SMN2基因的拷贝数越多，临床症状可能就越轻。这可以看做是假基因也并非完全无用的垃圾基因的经典案例。

为何假基因CYP21A1P会成为临床精准诊断CAH的干扰项

21-羟化酶缺乏性肾上腺皮质增生症是最先发现、研究最多、最常见的CAH (约占 95%)，是由于CYP21A2基因缺陷引发21-羟化酶失活所导致的。CYP21A2基因与无活性假基因CYP21A1P均由10个外显子组成，且外显子的DNA同一性为98%，内含子的DNA同一性为96%，两者高度同源。而这样的特性，也为21-羟化酶缺乏性肾上腺皮质增生症的精确诊断带来了困难。

在针对CYP21A2基因的检测策略中，以往采用长PCR扩增真基因区域，再进一步检测其中点突变或大片段缺失的方法；抑或采用MLPA技术对该基因大片段缺失及特定位点进行检测。

但以上的检测策略在面对CYP21A2基因真假基因转换时均存在检测局限性，报告结果也可能因假基因或CNV影响而引起临床精准诊断的困扰。

以下为临床案例：

 CYP21A2基因检测报告 (Sanger+qPCR)

临床送检CYP21A2基因 (Sanger+qPCR) 检测报告 (图1)，其中Sanger共检出6个致病位点: c.293-13 (IN2)、c.[710T>A;713T>A;719T>A] (EX6)、c.844 (EX6)、c.923 (EX7)、c.955 (EX8)、c.1069 (EX8)；qPCR未检出3号外显子缺失或重复。

临床医生对报告结果表示困惑：为何会有如此多的致病变异位点报出？他们是否构成复合杂合？是该患者的家族积累了这些致病变异位点，还是检测到假基因？为分辨真假基因，华大基因通过对样本进行Sanger+MLPA+高通量测序三种方法学联合检测，结果如下：

图片 ①号位点原报告与MLPA结果对照示意

1、MLPA对照高通量测序及Sanger测序结果显示，真基因存在c.293-13C>G (Ex2) 杂合位点，即下图中红框①号位点为真；

图片②号位点原报告与MLPA结果对照示意

图片③号位点原报告与高通量测序结果对照示意

2、MLPA、NGS检测结果对照Sanger测序结果表明，真基因中②号及③号所在的6-8号外显子区域存在一个杂合缺失；

基因转换示意图

3、②号及③号共5个突变位点与EX6-8杂合缺失的矛盾释疑：CYP21A2基因存在真假基因微转换 (Partial conversion) 的情形。

根据GeneReviews介绍：CYP21A2基因和CYP21A1P假基因的高度同源，常导致基因转换的发生；即功能性CYP21A2的片段被从CYP21A1P假基因复制的片段所取代。转换后的CYP21A2片段具有假基因的典型序列变体，这些变体多数是致病性，并且使正常的CYP21A2表达和/或正常蛋白质的翻译失活。

综上所述，推测该案例发生了真假基因6-8号外显子的微转换，导致对真基因进行长PCR扩增时，因微转换被插入的假基因区段也被一起扩增出来，故最终出现Sanger测序结果报出5个杂合位点的情形。结合Sanger、MLPA和NGS检测结果，该报告结果纠正为：c.293-13C>G het、Ex6-8微转换 (Partial conversion)。

从这个临床案例不难看出，无论使用单独的Sanger测通方法还是MLPA检测，都难以还原该样本中致病变异的真实情况，而检出位点也容易引起临床疑惑无法进行正确解读。

而采用Sanger+MLPA+高通量测序三种方法学的联合检测，则可让不同方法学检测结果之间相互印证和弥补。相比较于单纯的Sanger测通+qPCR，位点检出的准确率更高且可以更好地推断受检者变异的真实情况。

即使该基因存在真假基因微转换的情形，多种方法学结合检测也可以去伪存真，抽丝剥茧推断出真实的变异情形，从而避免报出困扰临床的位点。

参考文献：

[1] Vanin EF. Processed pseudogenes: characteristics and evolution. Annual Review of Genetics. 1985, 19: 253–72. PMID 3909943. doi:10.1146/annurev.ge.19.120185.001345
[2] Max EE. Plagiarized Errors and Molecular Genetics. Creation Evolution Journal. 1986, 6 (3): 34–46